除了上述的操作步骤，还有一个必须注意的，就是对照。阴性手唯对照，阳性对照，还有调节通道的，只加PI,只加AV，这些都要设计好，要不测出来的值不可信。
细胞接种后，每日计数细胞数，连续观察7-10日，在对数坐标纸上绘制细胞生长曲线，确定曲线基本呈水平的部分即为指数生长期（一般在2-6日）。 各种细胞是不同的，肿瘤细胞一般在传代12－24h后进入指数生长期，72h进入平台期。
对数斗差生长期是指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞会以对数生长，假如原来只有一个细胞，进入对数期以后毕销培就会变为两个，两个再变为四个，四个变为八个...即以2的N次方的速度生长(N为细胞的分裂次数)，在对数期生长速率远远大于死亡速率，所以在对数期最显著地特征就是细胞的数目大量增加，但当细胞经过一定时间的生长会消耗掉营养物质，产生大量的次生代谢产物使得pH值下降，其生长环境变得恶劣，此时生长速度下降，生长速率和死亡速率平衡，细胞的总个数基本保持不变，细胞的对数生长期结束进入平台期。
一、原理
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞稿敏膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素（FITC、PE）或Biotin 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，键吵枝利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的碰喊发生。
碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
二、方法
1、调整待检测细胞浓度为106个/ml，取200ul， 1000rpm×5min(4℃)。
2、预冷的PBS1ml 润洗两次2，1000rpm×5min(4℃)。
3、将细胞重悬于100ul binding buffer，加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。
4、转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上机前加入1ulPI（50ug/ml），2分钟后迅速检测。
5、同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。
三、注意事项
1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测
四、结果判定
以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；
左上象限为机械性损伤细胞；
右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；
左下为阴性正常细胞；
右下为早期凋亡细胞。
记得阴性对照，阳性对照，还有调节通道